SARS-CoV-2 virüsü spike proteininin genomik analizi

Türkçe Özet :
Giriş ve Amaç: Aralık 2019da, Çinin Hubei eyaletine bağlı Wuhan şehrinde nedeni bilinmeyen bir pnömoni salgını yaşandı. Salgından sorumlu yeni koronavirüs ve ilişkili pnömoni sırasıyla şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) ve koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19) olarak adlandırıldı. Koronavirüslerin spike proteini viral enfeksiyon, bulaşıcılık ve antijenitede önemli rol oynar. Bu nedenle, SARS-CoV-2deki spike proteininin genetik karakteri, kökeni ve evrimine ışık tutabilir. Genetik varyans analizleri, salgını kontrol altına alacak önlemler almak için bu yeni virüs hakkındaki bilgileri genişletmede artık çok önemli bir rol oynamaktadır. Mutasyonların sürekli izlenmesi, virüsün bireyler arasındaki ve coğrafi alanlar arasındaki hareketini izlemede de çok önemli olacaktır. Çalışmamızda SARS-CoV-2 virüsünün spike gen bölgesinde meydana gelen genetik değişiklikleri analiz etmeyi amaçladık. Materyal ve Metot: 2021 Ağustos ayında, KSÜ Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarına gönderilen kombine burun-boğaz sürüntü örneklerinden SARS-COV-2 Realtime PCR testi pozitif bulunan 60 örnek çalışmaya dahil edildi. Örneklerden HibriGen Genel RNA İzolasyon Kiti ile viral RNA izolasyonu yapıldı. İzolasyon sonucu elde edilen RNA örneklerinden revers transkripsiyonla cDNA sentez edildi. Bunun için abmgood OneScript® Plus cDNA Sentez Kiti kullanıldı. cDNA örneklerine Solis Biodyne HOT FIREPol® DNA Polimeraz Kiti kullanılarak PCR işlemi uygulandı. Oluşan ürünlerin nükleotid dizi analizi KSÜ ÜSKİM Merkez Sekans Laboratuvarında Sanger yöntemiyle yapıldı. Elde edilen nükleotid dizileri, SARS-CoV-2 Wuhan izolatı (NC_045512.2) referans alınarak Sequencher 5.4.6 programında birleştirildi ve konsensus dizileri çıkarıldı. Konsensus dizilerindeki mutasyonların analizinde, soy belirlenmesinde ve dendrogram oluşturulmasında Nextclade v1.7.1 platformu kullanıldı. Bulgular: Çalışmamızda incelediğimiz 60 SARS-CoV-2 izolatının S gen bölgesi, referans Wuhan (NC 045512.1) S dizisi ile karşılaştırıldığında izolatların tamamında çeşitli mutasyonlar tespit edildi. Saptanan mutasyonlardan 36sı nonsinonim (yanlış anlamlı), 19u sinonim (sessiz) mutasyonlardı. Nonsinonim mutasyonlar T19R (n=60), T478K (n=60), D614G (n=60), P681R (n=60), D950N (n=60), L452R (n=59), G142D (n=58), T95I (n=37), I850L (n=8), T29A (n=5), T250I (n=4), E1202Q (n=3), E281Q (n=2), D1163Y (n=2), V915I (n=1), T696S (n=1), G1219C (n=1), V1228L (n=1), I742N (n=1), Q1071L (n=1), A27V (n=1), A372S (n=1), P330L (n=1), D442A (n=1), W258R (n=1), G1124C (n=1), D1118H (n=1), P174S (n=1), G769V (n=1), N185D (n=1), G1267R (n=1), R21I (n=1), V1122L (n=1), M153I (n=1), V382L (n=1) ve A67T (n=1) olarak tespit edildi. Sinonim mutasyonlar ise C23557T (n=7), C21721T (n=4), T22261C (n=2), T23521C (n=1), C23086T (n=1), G24124A (n=1), G24928T (n=1), C24865T (n=1), C22783T (n=1), T23794G (n=1), T22849C (n=1), C22597T (n=1), C23683T (n=1), C22993T (n=1), C21772A (n=1), G24526A (n=1), C23290T (n=1), C22858T (n=1) ve G22708A (n=1) olarak bulundu. Ayrıca tüm izolatların 22029-22034 nükleotid pozisyonlarında iki aminoasite karşılık gelen delesyon saptandı (E156-, S:F157-, S:R158G). En sık saptanan nükleotid mutasyonu C>T (n=15; 10u sinonim, 5i nonsinonim), ikinci sıklıkta G>T (n=11; 10u nonsinonim, 1i sinonim) idi. Referans dizisi ve izolatlar Nextclade v1.7.1 (clades.nextstrain.org) ile karşılaştırılıp dendrogram oluşturulduğunda 60 örneğin tamamı 21A (Delta) soyu ile gruplanmıştır. Sonuç: Çalışmamızda S gen bölgesinde meydana gelen mutasyonları incelemek için örneklere dizi analizi yapılmıştır. Kısa zaman aralığında ve az sayıda örnekle yapmış olduğumuz çalışmamızda birçok farklı mutasyon tespit edilmiştir. SARS-CoV-2 genetik çeşitliliğini ve pandemide ortaya çıkan mutasyonları izlemek, evrimini anlamak COVID-19a karşı tanı, tedavi ve aşı etkiniliğini sağlamak için çok önemlidir. SARSCoV- 2 mutasyonları diğer RNA virüslerine kıyasla daha düşük oranda gözlenmesine karşın, enfekte kişi sayısının yüksek olması yeni varyantların ortaya çıkmasını kolaylaştırmaktadır. S genindeki mutasyonların virüsün ACE2 reseptörü ile etkileşimini etkileme potansiyeline sahip olması nedeniyle yeni mutasyonlar açısından S gen dizilerinin izlenmesi önemlidir. COVID-19 pandemisinin ciddi etkileri göz önünde bulundurulduğunda, bu konuda daha fazla araştırma yapılmasına gereksinim vardır.
İngilizce Başlık : Genomic analysis of SARS-CoV-2 virus spike protein
İngilizce Özet :
Introduction and Purpose: In December 2019, there was an epidemic of pneumonia of unknown cause in the city of Wuhan, Hubei province of China. The novel coronavirus responsible for the outbreak and associated pneumonia were named severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) and coronavirus disease 2019 (COVID-19). The spike protein of coronaviruses plays an important role in viral infection, infectivity and antigenicity. Therefore, the genetic character of the spike protein in SARS-CoV-2 may shed light on its origin and evolution. Genetic analysis of variance plays a very important role in learning new information about the virus in order to take measures to control the epidemic. Continuous monitoring of mutations will also be crucial in tracking the movement of the virus between individuals and between geographic areas. In our study, we aimed to analyze the genetic changes in the spike gene region of the SARS-CoV-2 virus. Materials and Methods: Among the combined nose-throat swab samples sent to KSU Medical Faculty Medical Microbiology Laboratory in August 2021, 60 samples with positive SARS-COV-2 Realtime PCR test were included in the study. Viral RNA was isolated from the samples with the HibriGen General RNA Isolation Kit. cDNA was synthesized by reverse transcription from RNA samples obtained as a result of isolation. For this, abmgood OneScript® Plus cDNA Synthesis Kit was used. The cDNA samples were PCRed using the Solis Biodyne HOT FIREPol® DNA Polymerase Kit. The nucleotide sequence analysis of the resulting products was performed in KSÜ ÜSKİM Central Sequence Laboratory using the Sanger method. The resulting nucleotide sequences were assembled in the Sequencher 5.4.6 program with reference to the SARS-CoV-2 Wuhan isolate (NC_045512.2) and consensus sequences were extracted. Nextclade v1.7.1 platform was used for analysis of mutations in consensus sequences, lineage determination and dendrogram creation. Results: When the S gene region of 60 SARS-CoV-2 isolates we examined in our study was compared with the reference Wuhan (NC 045512.1) S sequence, various mutations were detected in all isolates. Of the detected mutations, 36 were nonsynonymous (missense) and 19 were synonymous (silent) mutations. Nonsynonymous mutations T19R (n=60), T478K (n=60), D614G (n=60), P681R (n=60), D950N (n=60), L452R (n=59), G142D (n=58) , T95I (n=37), I850L (n=8), T29A (n=5), T250I (n=4), E1202Q (n=3), E281Q (n=2), D1163Y (n=2), V915I (n=1), T696S (n=1), G1219C (n=1), V1228L (n=1), I742N (n=1), Q1071L (n=1), A27V (n=1), A372S (n=1), P330L (n=1), D442A (n=1), W258R (n=1), G1124C (n=1), D1118H (n=1), P174S (n=1), G769V ( n=1), N185D (n=1), G1267R (n=1), R21I (n=1), V1122L (n=1), M153I (n=1), V382L (n=1), and A67T (n=1) = 1) was detected. Synonym mutations are C23557T (n=7), C21721T (n=4), T22261C (n=2), T23521C (n=1), C23086T (n=1), G24124A (n=1), G24928T (n=1) ), C24865T (n=1), C22783T (n=1), T23794G (n=1), T22849C (n=1), C22597T (n=1), C23683T (n=1), C22993T (n=1) , C21772A (n=1), G24526A (n=1), C23290T (n=1), C22858T (n=1) and G22708A (n=1). In addition, deletions corresponding to two amino acids were detected at nucleotide positions 22029-22034 of all isolates (E156-, S:F157-, S:R158G). The most common nucleotide mutation was C>T (n=15; 10 synonymous, 5 nonsynonymous), the second most common was G>T (n=11; 10 nonsynonymous, 1 synonymous). When the reference sequence and isolates were compared with Nextclade v1.7.1 (clades.nextstrain.org) and the dendrogram was established, all 60 samples were grouped with the 21A (Delta) strain. Conclusion: Sequence analysis was performed on the samples to examine the mutations in the S gene region in our study. Many different mutations were detected in our study, which we conducted in a short time period and with a small number of samples. Monitoring the genetic diversity of SARS-CoV-2 and the mutations that occur in the pandemic, understanding its evolution is very important to ensure diagnosis, treatment and vaccine effectiveness against COVID-19. Although SARS-CoV-2 mutations are observed at a lower rate compared to other RNA viruses, the high number of infected people facilitates the emergence of new variants. Since mutations in the S gene have the potential to affect the interaction of the virus with the ACE2 receptor, it is important to monitor the S gene sequences for new mutations. Considering the serious effects of the COVID-19 pandemic, more research is needed on this subject.